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細胞β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)活性比色法

更新時間:2023-02-22 點擊次數:762

MB50271.1 v.A

 

    細胞β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)活性比色法定量檢測試劑盒

產品說明書(中文版)

 

主要用途

 

    細胞β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物PNP-NAG受到β氨基己糖苷酶催化水解后,在堿性環境下,呈現黃色,即采用比色法來測定樣品中酶活性而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體細胞裂解懸液樣品中β氨基己糖苷酶的活性檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定。

 

技術背景

 

β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase;EC3.2.1.52.又稱為N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl--β-D-Glucosaminidase;NAGase)屬于含有20個糖苷水解酶(glycoside hydrolase)家族,也是肽聚糖水解酶,為溶酶體細胞器中的酶之一。其功能在于水解N-乙酰-β-D-氨基己糖苷中的末端N-乙酰-β-D-氨基己糖殘基(N-acetyl-D-hexosamine   residues),參與細胞內糖蛋白和糖脂的分解代謝,包括蛋白和中性糖脂中的寡糖、粘多糖等水解。具有宿主抗感染防御作用。β氨基己糖苷酶為同源二聚體結構,有αβ兩個亞體構成:HEXAHEXB。人體缺乏HEXAHEXB,將導致神經退行性相關的疾病,例如家族黑蒙性?。?/span>Tay-Sachs?。┖?/span>神經節苷脂貯積病  Sandhoff )。 基于底物4-硝基苯基 N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide;PNP-NAG),在β氨基己糖苷酶的作用下,水解釋放出硝基苯酚(p-nitrophenol)和N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(N-acetyl-β-D-glucosamine;NAG,在堿性環境下,呈現出黃色,在分光光度儀下,產生吸光峰值變化405nm 波長),來定量分析β氨基己糖苷酶的活性。反應系統為:

         

產品內容

 

    緩沖液(Reagent A         毫升

    反應液(Reagent B         毫升

    堿性液(Reagent C           毫升

    陰性液(Reagent D           微升

    清理液(Reagent E         毫升

    裂解液(Reagent F         毫升

產品說明書               1

 

保存方式

 

保存    反應液(Reagent B在-20冰箱里,避免光照;其余的保存在4冰箱里,有效保證6

 

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒:用于細胞脫離

(微型)臺式離心機:用于樣品操作

比色皿或96孔板:用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標儀:用于比色分析

 

實驗步驟

 

一、 樣品準備

 

1. 準備好75cm2細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞(15 X 107細胞)

2. 小心加入xx毫升    清理液(Reagent E,覆蓋生長表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:可以使用胰酶消化

5. 加入xx毫升    清理液(Reagent E,混勻細胞

6. 移入到預冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始

7. 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入xx微升    裂解液(Reagent F,充分混勻

10. 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11. 強力渦旋震蕩15

12. 置于冰槽里孵育30分鐘

13. 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

14. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用     Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-GMS30030.1

16. 即刻放進-70保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、 測定準備

 

1. 準備好待測樣品(例如細胞裂解萃取懸液樣品等),置于冰槽里

2. 設定好分光光度儀(溫度為37℃):波長405nm,并置零

3.     緩沖液(Reagent A室溫下均衡溫度

 

三、 背景對照測定

 

1. 移取xx微升    緩沖液(Reagent A到新的比色皿

2. 加入xx微升    反應液(Reagent B

3. 加入xx微升    陰性液(Reagent D

4. 上下傾倒數次,混勻

5. 37℃溫度下孵育10分鐘

6. 加入xx微升    堿性液(Reagent C

7. 上下傾倒數次,混勻

8. 37℃溫度下孵育5分鐘

9. 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照

 

四、 樣品測定

 

1. 移取xx微升    緩沖液(Reagent A到新的比色皿

2. 加入xx微升    反應液(Reagent B

3. 加入50微升待測樣品(50微克蛋白)(注意:樣品須清澈,且pH小于7.5

4. 上下傾倒數次,混勻

5. 37℃溫度下孵育10分鐘

6. 加入xx微升    堿性液(Reagent C

7. 上下傾倒數次,混勻

8. 37℃溫度下孵育5分鐘

9. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數 

 

四、計算樣品活性

 

五、 酶標儀測定

 

1. 96孔板上做好相應標記:背景對照和樣品

2. 分別移取xx微升    緩沖液(Reagent A到相應孔

3. 分別加入xx微升    反應液(Reagent B

4. 分別加入xx微升    陰性液(Reagent D待測樣品(20微克蛋白)(注意:樣品須清澈,且pH小于7.5

5. 輕輕搖動96孔板

6. 37溫度下孵育10分鐘

7. 分別加入xx微升    堿性液(Reagent C

8. 輕輕搖動96孔板

9. 37溫度下孵育5分鐘

10. 即刻放進酶標儀檢測 

11. 活性計算

 

注意事項

 

1. 本產品為20次操作,包括背景對照

2. 操作時,須戴手套

3. 系統操作過程中,背景測定只需1

4. 樣品須澄清,至關重要

5. 建議使用比色皿測定

6. 加樣后3秒內比色測定

7. 測定值由變化;測定可持續10分鐘

8. 比色測定后,比色皿須清洗

9. 樣本測定10分鐘讀數0分鐘讀數表明具有酶活性

10. 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升;如果樣本酶活性過低或過高,則可以增加或降低樣本量(本公司提供      Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1

11. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度

12. β氨基己糖苷酶單位活性定義為:在37,pH 4.25條件下,每分鐘內能夠釋放1微摩爾硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位

13. 本公司提供系列細胞酶學檢測試劑產品

 

質量標準

 

1. 本產品經鑒定性能穩定

2. 本產品經鑒定檢測敏感

 

 


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